Oloa
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR Pusa Su'esu'ega mo le 2019-nCoV
Fa'amoemoe fa'aoga
O lenei pusa o loʻo faʻaaogaina mo le suʻesuʻeina lelei o le coronavirus fou (2019-nCoV) e faʻaaoga ai swabs faʻaʻi, nasopharyngeal swabs, bronchoalveolar lavage fluid, sputum. faʻamaoniga mo suʻesuʻega faʻapitoa ma togafitiga.O se suʻesuʻega atoatoa o le tulaga e fautuaina e tuʻufaʻatasia ma faʻaaliga a le tagata maʻi ma isi suʻega suʻesuʻe.
Ta'iala ole asiasiga
O le pusa e faʻavae i luga ole laʻasaga tasi RT-PCR tekinolosi.O le mea moni, o le 2019 fou coronavirus (2019-nCoV) ORF1ab ma N genes na filifilia e avea ma faʻalapotopotoga faʻalautele.O su'esu'ega fa'apitoa ma su'esu'ega fa'amalama (N gene su'esu'e ua fa'ailoga ile FAM ma le ORF1ab su'esu'e ua fa'ailogaina ile HEX) ua mamanuina e su'e ai le 2019 fou-ituaiga coronavirus RNA i fa'ata'ita'iga.O lo'o iai fo'i i le pusa se faiga e su'esu'e ai totonu (internal control gene probe fa'ailoga i le CY5) e mata'itū ai le fa'agasologa o le aoina mai o fa'ata'ita'iga, RNA ma le PCR fa'ateleina, ma fa'aitiitia ai i'uga leaga sese.
Vaega autu
| Vaega | Volume(48T/Pusa） |
| RT-PCR fofo tali | 96µl |
| NCOV primer TaqMan probemixture（ORF1ab,N Gene,RnaseP Gene） | 864µl |
| Le pulea lelei | 1500µl |
| nCOV Fete'ena'iga lelei(l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
Lave reagents: RNA extraction po'o le fa'amamāina reagents.Le lelei / pulea lelei: O le pulea lelei o le RNA o loʻo i ai le vaega faʻatatau, aʻo le pulea lelei o le vai e leai se vai.I le taimi o le faʻaaogaina, e tatau ona latou auai i le aveeseina ma e tatau ona manatu e faʻamaʻi.E tatau ona taulimaina ma lafoai e tusa ai ma tulafono faatonutonu talafeagai.
O le kenera faasinomaga i totonu o le kenera RnaseP tagata.
Tulaga teuina ma aso e muta ai
-20 ± 5 ℃, aloese mai le fa'amalo fa'asolo ma fa'afefeteina sili atu i le 5 taimi, aoga mo le 6 masina.
Mea faigaluega talafeagai
Faatasi ai ma le FAM / HEX / CY5 ma isi mea faigaluega PCR fluorescent multi-channel.
Fa'ata'ita'iga mana'oga
1. Tulaga fa'ata'ita'iga talafeagai: fa'a'i fa'a'a'a, fa'asu'u nasopharyngeal, bronchoalveolar fufulu vai, sputum.
2. Aoina mai o fa'ata'ita'iga (septic technique)
Fufulu faufau: solo le tonsils ma le puipui pito i tua o le pharyngeal i ni pulupulu se lua i le taimi e tasi, ona faatofu lea o le ulu o le solo i totonu o se paipa su'ega o loʻo i ai le vaifofo faʻataʻitaʻiga.
Sputum: A uma ona tale tele le tagata ma'i, ao mai le fuga ua tale i totonu o se faagaau su'esu'e sikulima o lo'o i ai le vaifofo sampling;bronchoalveolar lavage vai: Fa'ata'ita'iga e foma'i.3.Storage ma felauaiga o faʻataʻitaʻiga
O faʻataʻitaʻiga mo le faʻaesea o siama ma suʻega RNA e tatau ona suʻeina i se taimi vave e mafai ai.O faʻataʻitaʻiga e mafai ona iloa i totonu ole 24 itula e mafai ona teuina ile 4℃;mea e le mafai ona iloa i totonu ole 24
itula e tatau ona teuina i le -70 ℃ pe i lalo (afai e leai se tulaga e teu ai -70 ℃, e tatau ona
teu le tumau ile -20 ℃ pusaaisa).O fa'ata'ita'iga e tatau ona 'alofia le fa'a'aisa fa'alua ma le fa'afefe i le taimi o felauaiga.E tatau ona lafo fa'ata'ita'i ile fale su'esu'e i se taimi vave pe a uma ona aoina.Afai e mana'omia le fe'avea'i o fa'ata'ita'iga i se mamao mamao, e fautuaina le teuina o le aisa mago.
Metotia Su'ega
1 Fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga ma le RNA fa'atosina (fa'ata'ita'iga fa'ameamea)
E fautuaina e ave le 200μl o faʻataʻitaʻiga vai mo le faʻaaogaina o le RNA.Mo fa'asagaga fa'atatau i la'asaga, va'ai i fa'atonuga o pusa fa'atau RNA fa'apisinisi.Le lelei ma le leaga
fa'atonuga i totonu o lenei pusa sa aofia i le fa'aputuina.
2 tapenaga fa'ameamea ole PCR
2.1 Aveese uma vaega mai le pusa ma fa'afefe ma fa'afefiloi ile vevela potu.Centrifuge i le 8,000 rpm mo ni nai sekone aʻo leʻi faʻaaogaina;fuafua le aofaiga mana'omia o reagents, ma ua saunia le faiga e tali atu ai e pei ona fa'aalia i le siata lenei:
| Vaega | N tautua (25µl system) |
| nCOV primer TaqMan probemixture | 18 µl × N |
| RT-PCR fofo tali | 2 µl × N |
| *N = numera o faʻataʻitaʻiga na suʻeina + 1 (pulega leaga) + 1 (nCOVpulea lelei) | |
2.2 A maeʻa ona faʻafefiloi lelei vaega, centrifuge mo sina taimi puʻupuʻu e tuʻu uma le vai i luga o le puipui o le paipa e pa'ū i le pito i lalo o le paipa, ona faʻafefe ai lea o le 20 μl faʻapipiʻi faʻapipiʻi i totonu o le PCR tube.
3 Fa'ata'ita'iga (nofoaga sauniuni mo fa'ata'ita'iga)
Faʻaopoopo le 5μl o le leaga ma le lelei faʻatonuga pe a uma ona aveese.O le RNA o le faʻataʻitaʻiga e suʻe e faʻaopoopo i le PCR reaction tube.
Ufi fa'amau le fa'agaau ma fa'a'ese'ese i le 8,000 rpm mo ni nai sekone a'o le'i tu'uina atu i le vaega e iloa ai le fa'alauteleina.
4 PCR fa'ateleina (fa'ateleina le su'esu'ega)
4.1 Tuu le paipa tali i totonu o le sela faʻataʻitaʻi o le meafaigaluega, ma seti faʻamaufaʻailoga e pei ona taua i lalo:
| tulaga | Ta'amilosaga numera | vevela(°C) | Taimi | aoinanofoaga |
| Fa'afo'ifa'aliliuga | 1 | 42 | 10min | - |
| A'o lei-denaturation | 1 | 95 | 1min | - |
| Ta'amilosaga | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30s | aoina o fa'amaumauga |
Filifiliga alavai e iloa ai meafaigaluega: Filifili le ala FAM, HEX, CY5 mo le faailo o le fluorescence.Mo fa'asinoga fa'alelei LEAI, fa'amolemole aua le filifilia ROX.
5 Su'esu'ega i'uga (Fa'amolemole va'ai i fa'atonuga fa'ata'ita'iga o meafaifa'aili ta'itasi mo le fa'atulagaina)
A mae'a le tali, fa'asaoina iuga.A maeʻa suʻesuʻega, fetuutuunai le tau amata, faʻaiʻuga tau, ma le faʻailoga o le laina faʻavae e tusa ai ma le ata (e mafai e le tagata faʻaoga ona fetuunai e tusa ai ma le tulaga moni, e mafai ona seti le tau amata i le 3 ~ 15, e mafai ona seti le tau faaiʻu i le 5 ~ 20, fetuutuunai) i le kalafi logarithmic I le faitotoʻa o le faamalama, o le laina faʻailoga o loʻo i totonu o le vaega logarithmic, ma o le faʻalauteleina o le faʻaogaina o le pule le lelei o se laina saʻo poʻo lalo ifo o le laina laina).
6 Fa'atonuga fa'atatau (O lo'o iai le fa'atonuga i totonu ole su'ega) Fa'atonuga le lelei: Leai se fa'ailoga fa'aopoopo fa'apitoa mo FAM, HEX, CY5 alavai e iloa ai.
Pulea lelei COV: fa'asolo manino le fa'atuputeleina ole FAM ma le HEX auala e iloa ai, Ct value≤32, ae leai se fa'aupuga fa'ateleina ole ala CY5;
O mana'oga o lo'o i luga e tatau ona ausia i le taimi e tasi i le fa'ata'ita'iga tutusa;a leai, e le aoga le fa'ata'ita'iga ma e mana'omia ona toe fai.
7 Filifiliga o taunuuga.
7.1 Afai e leai se pupuni fa'alautele po'o le tau o le Ct> 40 i le FAM ma le HEX o le fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga, ma o lo'o i ai se fa'aopoopoga fa'aopoopo i le ala CY5, e mafai ona fa'amasinoina e leai se 2019 coronavirus fou (2019-nCoV) RNA i le faʻataʻitaʻiga;
.2 Afai o le fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga o lo'o i ai ni pi'o fa'alautele manino i le FAM ma le HEX, ma o le tau Ct e ≤40, e mafai ona fa'amasinoina o le fa'ata'ita'iga e lelei mo le coronavirus fou 2019 (2019-nCoV).
7.3 Afai o le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai se pupuni faʻamalosi manino i le tasi alalaupapa o le FAM poʻo le HEX, ma o le tau o le Ct o le ≤40, ma e leai se faʻaopoopoga faʻamalosi i le isi auala, e manaʻomia le toe suʻeina o taunuuga.Afai e tumau fa'ai'uga toe su'ega, e mafai ona fa'amasinoina le fa'ata'ita'iga e lelei mo le mea fou
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Afai e le lelei le fa'ai'uga o le toe su'ega, e mafai ona fa'amasinoina e le lelei le fa'ata'ita'iga mo le 2019 coronavirus fou (2019-nCoV).
Fa'amasinoga lelei
O le ROC curve auala e faʻaaogaina e fuafua ai le faʻamatalaga CT tau o le pusa ma le faʻaogaina o le faʻaogaina o le tau o le 40.
Fa'amatalaga o fa'ai'uga o su'ega
1. E tatau ona faʻataʻitaʻiina faʻataʻitaʻiga taʻitasi mo pulega le lelei ma lelei.Fa'atoa mafai ona fa'amauina fa'ai'uga o su'ega pe a fa'amalieina mana'oga fa'atonutonu lelei
2. Pe a lelei le faʻaogaina o le FAM ma le HEX, o le iʻuga mai le CY5 channel (faʻatonuga i totonu) atonu e le lelei ona o le tauvaga faiga.
3. Pe a leaga le i'uga o le fa'alotoifale, pe afai e le lelei fo'i le fa'aogaina o alavai ole FAM ma le HEX, o lona uiga ua le atoatoa le faiga po'o le fa'agaioiga e sese, e le aoga le su'ega.O le mea lea, e tatau ona toe suʻeina faʻataʻitaʻiga.
